【技術方法】過氧化氫(CAT)活力測定

過氧化氫(CAT)檢測試劑盒(鉬酸銨比色法)

上海源葉生物科技有限公司

產品組成

編號

名稱

R1885

R21885

Storage

試劑(A):H2O2基液

5 ml

10 ml

4℃

試劑(B):CAT Assay buffer

52ml

104 ml

4℃,避光

試劑(C): MO顯色液

50ml

100 ml

4℃,避光

使用說明書

一份

 

自備材料:

  1. 蒸餾水、生理鹽水

  2. 比色杯

  3. 分光光度計

 

操作步驟(僅供參考):

1、配制65Mm H2O2基液

本試劑盒提供的H2O2基液中的H2O2濃度約為1M。由于過氧化氫不是非常穩定,使用前需自行測定過氧化氫的實際濃度。把濃度約為1M的H2O2基液用本試劑盒提供的CATAssay buffer稀釋100倍,使H2O2基液中的H2O2濃度約為10 mM。分光度計測定A240(一般情況下,新配制的10 mM H2O2基液A240在0.45左右,經過3個月以后A240在0.42左右),H2O2濃度(mM)=22.94×A240。進而計算出本試劑盒提供的H2O2基液中的H2O2實際濃度。然后再根據實際的過氧化氫濃度,配制65mM H2O2基液。

 

2、準備樣品

①細胞或組織樣品:取恰當細胞或組織進行裂解,可以采用Western 及IP細胞裂解液,如果有必要需進行適當勻漿,低速離心取上清,-70℃凍存,用于CAT的檢測。

②血漿、血清和尿液樣品:血漿、血清按照常規方法制備,用生理鹽水10倍稀釋后,可以直接用于本試劑盒的測定,尿液通常也可以直接用于測定,-70C凍存,用于CAT的檢測。③全血樣品:收集適量的全血(wholeblood)至一抗凝管內,顛倒混勻。取100 μl全血凍融一次,用CAT Assay buffer 1000倍后進行CAT檢測。

④血液中的紅細胞裂解液:用抗凝管收集血液,顛倒混勻。取至少500 μl全血4℃ 3000 g離心5 min,棄上清,沉淀用預冷的生理鹽水洗滌3次。用約5倍細胞體積的預冷的去離子水,例如Milli-Q 純水,重懸細胞沉淀,冰浴10 min。使用前用CAT Assay buffer稀釋400倍后進行CAT檢測。

⑤高活性樣品:如果樣品中含有較高活性的CAT,可以使用CAT Assay buffer 稀釋。

⑥(選做)樣品準備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,以便于后續計算單位蛋白質重量組織或細胞內的CAT含量。

 

3、CAT加樣

按照下表設置空白管、自身對照管、測定管,溶液應按照順序依次加入,并注意避免產生氣泡。如果樣品中的醇活性過高,可以減少祥品用最或適當稀釋后再進行測定,樣品的檢測最好能設置平行管/孔。

 

分光光度計法,反應體系設置如下:

加入物(ml)

空白管

自身對照管

測定管

CAT Assay buffer

0.1

待測樣品

0.1

65 mM H2O2基液(37C預溫5min)

1.0

1.0

1.0

立即混勻,置于37C水浴,準確孵育60s.

待測樣品

0.1

MO顯色液

1.0

1.0

1.0

 

 

4、CAT測定

分光光度計檢測405 nm處吸光度,分光光度計比色杯光徑0.5 cm。如果沒有分光光度計,亦可用酶標儀檢測,但如果有條年,盡量采月分光光度計檢測。蒸餾水調零,讀取各管吸無度。

 

計算:

CAT活性單位的定義: 在37℃ 1min內催化水解1μmol過氧化氫量為一個CAT酶活力

  讀取各管吸光度。單位。根據酶活性定義,計 算出樣品中的CAT活性。

 

血清、血漿、尿液中CAT活力計算公式:

血清樣品CAT活力(U/m1)= {(A 自身對照-A測定)/A空白} ×650×N

 

組織、細胞中CAT活力計算公式:  {(A 自身對照-A測定)/A空白} ×650/待測樣品血紅蛋白濃度(mg/ml)

 

式中:A 自身對照= 自身對照的吸光度值

A測定=待測樣品的吸光度值

A空白=空白的吸光度值N=待測樣品檢測前的稀釋倍數注意事項:

 

注意事項

1、本試劑盒亦可用酶標儀進行檢測,但檢測的樣本數相應增多。如果有條件,盡量采用分光光度計檢測。

2、待測樣品中不能含有CAT抑制劑,同時需避免反復凍融。

3、CAT Assay buffer 如果出現渾濁或絮狀物,應棄用。

4、完整的紅細胞以及未稀釋的溶血液中的過氧化氫酶置于4℃一周仍然很穩定,稀釋后的溶血液中CAT容易失活。

5、應避免冰凍樣品造成溶血,否則過氧化氫酶活性會下降10%~15%。

6、血清樣品室溫下3d內活性下降64.7%,4℃下下降10.5%,-20℃下保存30d活性僅下降3.5%。因此,待測樣品均應-20℃或-70℃保存。

7、為了您的安全和健康,請穿試驗服并戴一次性手套操作。

有效期:12個月。

 

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